Anal Chem｜东南大学研究团队：联合应用高性能磁珠与纳米酶实现多模态快速检测恶性淋巴瘤细胞外囊泡
日期：
2025-07-24
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细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）作为肿瘤诊疗领域的重要生物标志物和微环境调控介质，通过转运蛋白质、核酸等活性分子参与肿瘤血管生成、免疫逃逸和转移等关键病理过程。以淋巴瘤为例，其EVs上的CD20蛋白已成为疾病分型和疗效评估的重要靶标。然而，当前EVs富集和检测技术面临三重挑战：（1）传统超速离心法富集效率低且样本损耗大；（2）现有检测方法难以兼顾高灵敏度与高特异性；（3）操作流程复杂导致结果可重复性差。
针对上述问题，东南大学张宇教授团队在Analytical Chemistry杂志上发表题为 “Nanozyme-enabled multimodal sensing: visual and rapid profiling of extracellular vesicles” 的研究论文, 该研究提出了一种基于Fe₃O₄@TiO₂亲和磁珠的富集技术和CuCo-ZIF/Pt纳米酶催化系统，结合人工智能分析平台，实现了淋巴瘤EVs上CD20的高效富集和检测。这一多模态传感策略由王萧作为第一作者，马明副研究员、葛峥教授和张宇教授作为通讯作者共同完成，为淋巴瘤的精准诊断和疗效监测提供了新的技术平台。
方案1. 机器学习辅助纳米酶多模态传感器检测sEVs浓度示意图。(A) 信号标签的合成。(B) 免疫传感器的组装及工作原理。(C) 基于CuCo-ZIF/Pt对sEVs的比色和荧光双模态响应机制。(D) 基于比色图像的机器学习辅助sEVs检测示意图。
通过TEM、NTA和WB分析确定了sEVs的成功富集。优化实验表明，使用1.4 mg Fe₃O₄@TiO₂磁珠孵育7 min可实现91.34%的捕获率，荧光显微图像结果进一步验证了Fe₃O₄@TiO₂磁珠可以有效捕获sEVs。
图 1. sEVs 的特征。(A) sEVs的TEM图像。(B) NTA分析显示了sEVs的大小和浓度。(C) WB分析证明了CD63、CD20和TSG101的表达。(D) 用于富集sEVs的Fe3O4@TiO2磁珠用量的优化。(E) 优化分离sEVs的孵育时间。(F) (a-c) Fe3O4@TiO2磁珠/sEVs的明场图像、荧光图像和融合图像；(d-f) Fe3O4@TiO2磁珠的明场图像、荧光图像和融合图像
采用原位沉积法合成 CuCo-ZIF/Pt纳米酶。通过SEM与TEM可以看出CuCo-ZIF/Pt呈立方体结构，Pt NPs负载在CuCo-ZIF的表面；EDS、XRD证实Cu、Co、Pt元素的存在且晶体结构保持完整；XPS、FTIR进一步验证金属掺杂及Pt NPs成功负载，构建出结构完整、分散性良好的CuCo-ZIF/Pt纳米酶。
图 2：CuCo-ZIF/Pt的结构特征。(A) CuCo-ZIF/Pt的合成示意图。(B) CuCo-ZIF和(C) CuCo-ZIF/Pt的SEM。(D) CuCo-ZIF和(E) CuCo-ZIF/Pt的TEM。(F) CuCo-ZIF/Pt的EDS图和(G) EDS光谱。(H) CuCo-ZIF/Pt的XRD。(I) XPS和(J) FTIR图。
CuCo-ZIF/Pt纳米酶表现出优异的类氧化酶活性，能够催化邻苯二胺 (OPD)氧化生成2,3-二氨基吩嗪 (DAP)，并产生420 nm处吸收和570 nm处荧光的双信号响应。与CuCo-ZIF相比，CuCo-ZIF/Pt的催化效率显著提高，这归因于Pt NPs的增强作用。机理研究表明，其催化活性主要来源于•OH和O2•–的参与。在N₂环境中催化活性降低34.3%，而在O₂环境中活性提高28.8%，进一步证实了氧依赖性催化机制。此外，该材料展现出良好的稳定性，经过三次循环使用后仍能保持80%以上的初始活性。基于其优异的催化性能和稳定性，CuCo-ZIF/Pt纳米酶在复杂生物样品的检测中具有重要的应用潜力。
图 3. CuCo-ZIF/Pt类氧化酶活性的表征。(A) OPD、CuCo-ZIF+OPD和CuCo-ZIF/Pt+OPD体系的紫外-可见吸收光谱。插图：不同反应体系的颜色变化照片。(B) OPD、CuCo-ZIF + OPD 和CuCo-ZIF/Pt + OPD的时间-吸光度曲线。(C) 不同纳米酶的anano比较。(D) CuCo-ZIF/Pt 对OPD的酶促反应动力学和 (E)相应的双倒数图。(F) 不同气体饱和条件OPD/CuCo-ZIF/Pt溶液的吸光度变化。(G) 不同自由基清除剂对CuCo-ZIF/Pt类氧化酶活性的影响。(H) DMPO捕获的•OH和O₂•–以及TEMP捕获的¹O₂的ESR谱图。(I) CuCo-ZIF/Pt纳米酶的重复使用性能。
电化学测试结果表明，Pt NPs的引入显著增强了CuCo-ZIF电荷传递能力并提高了活性位点密度。DFT计算揭示Co和Pt为主要的O₂吸附活性中心，其中CuCo-ZIF/Pt对O₂结合能力更强，有效促进了OOH*→OH*→H₂O的反应路径。XPS分析证实，催化反应后Cu²⁺和Co³⁺被还原为Cu⁺和Co²⁺，同时Pt²⁺的相对含量增加。这些结果共同表明，高价态金属直接参与了OPD的氧化过程，并与反应过程中产生的活性氧物种（ROS）协同完成催化循环。
图4. CuCo-ZIF/Pt类氧化酶催化机理研究。(A) EIS奈奎斯特图。(B) 5 mV/s下的LSV曲线。(C) 腐蚀电位极化曲线。(D) CuCo-ZIF/Pt优化吸附构型的O2还原反应路径。(E) CuCo-ZIF和CuCo-ZIF/Pt类氧化酶反应对应的自由能图。反应前后(F) Cu、(G) Co和(H) Pt的XPS图谱。
该多模态生物传感器在优化条件下表现出卓越的分析性能。在比色模式下，其线性检测范围为4.7×10⁴-9.4×10⁶ 个/μL，检测限为3.2×10⁴ 个/μL；荧光检测模式同样呈现良好线性，检测范围为9.4×10²-9.4×10⁶ 个/μL，检测限为8.05×102 个/μL。实验结果表明，该传感器具有优异的选择性、重复性和稳定性。通过结合ResNet18-DA人工智能平台，基于8000张训练图像构建的智能识别系统可实现1秒内的快速检测，准确率超过99.5%。该集成系统突破了传统检测方法的局限性，为sEVs的即时检测提供了新的解决方案。
图5. CuCo-ZIF/Pt纳米酶对sEVs的多模态传感性能分析。(A) 生物传感器对不同浓度sEVs 的比色响应。(B) 吸光度值与sEVs浓度之间的关系。(C) 在 4.7×104-9.4×106个/μL的范围内，吸光度值与sEVs浓度之间的线性关系。(D) 生物传感器对不同浓度sEVs的荧光响应。(E) 荧光强度与sEVs浓度之间的关系。(F) 在 9.4×102-9.4×106个/μL 的范围内，荧光强度与 sEVs浓度之间的线性关系。(G) ResNet18-DA 模型训练过程示意图，包括一个输入层、一组隐藏层和一个输出层。(H) 使用 ResNet18-DA 模型预测sEVs浓度的混淆矩阵。(D) 基于比色图像的机器学习辅助sEVs检测示意图。
该生物传感器在24例临床样本验证中展现出优异的诊断性能。采用梯度离心结合0.22 μm滤膜预处理的血浆样本检测表明，淋巴瘤患者组sEVs的CD20标志物信号强度显著高于健康对照组（P<0.001，t检验）。与ELISA金标准方法相比，该传感器在诊断效能上具有明显优势，比色检测模式的受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到0.948，荧光检测模式AUC为0.963（ELISA方法AUC=0.933），且具有更高的灵敏度和更短的检测时间。基于ResNet18-DA模型对临床样本的预测准确率良好。这些结果表明，该传感器在淋巴瘤临床诊断中具有显著优势，其高灵敏度和特异性为肿瘤生物标志物的检测提供了新工具。
图 6. 健康受试者和淋巴瘤患者的血浆sEVs分析。(A) 血浆 sEVs 的分析过程。(B) 比色法和荧光法检测不同人群中的sEVs浓度。(C) 临床血浆样本中sEVs上CD20检测的ROC曲线。
综述所述，本研究成功构建了一种基于纳米酶的多模态传感平台，实现了淋巴瘤EVs上 CD20的检测。该平台具有三大优势：(1) 采用Fe₃O₄@TiO₂亲和磁珠实现sEVs快速富集；(2) 基于CuCo-ZIF/Pt纳米酶催化系统无需H₂O₂即可产生比色和荧光双响应信号；(3) 集成ResNet18-DA深度学习模型，实现1秒内智能分析，准确率接近100%。该技术为淋巴瘤诊断和疗效评估提供了高效、精准的新方法。
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