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产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌

日期: 2023-12-05
浏览次数: 42

随着农业和医学中抗生素的过度使用,多重耐药(MDR细菌已经成为全球人类健康的主要危害。此外,由于可用的药物治疗方案有限,造成了额外的负担。因此,迫切需要开发有效的早期鉴别方法,以确保迅速消除MDR细菌。

迄今为止,已经开发了多种用于临床检测MDR细菌的方法。传统的基于培养的生化检测易受感染风险,且通常需要几天的时间,进而导致治愈过程和疾病控制的延迟,但仍是细菌学领域的黄金标准。基于聚合酶链式反应(PCR)方法的大规模应用受到多种因素的制约,如需要专业操作、清洁环境以及缺乏高通量操作。因此,亟需一种快速、灵敏的方法来高效检测低丰度MDR细菌。

为了解决这一问题,研究人员将免疫磁分离(IMS)与基于金纳米粒子(GNP)的动态光散射(DLS)技术和荧光技术配合使用,MDR细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)首先被AptMBs(适配体功能化标记羧基磁珠,磁珠选自南京东纳生物科技有限公司)特异性捕获并分离,随后,引入适配体-探针双链体修饰的GNPAptGNP)来识别收集的靶标并形成“AptGNP包被细菌”复合物,而AptGNP从分散到聚集的状态变化引起快速且超灵敏的DLS信号变化,同时,目标 MDR 细菌释放探针,呈现出阳性荧光信号,充当“关闭到开启”的荧光纳米开关。结果表明,所提出的双模式适配体传感平台(DAPT)可以实现MRSA的超灵敏检测(LOD4.63 CFU mL1)。(研究工作发表在Biomater. Sci., 2023, 11, 1754–1764 IF6.6)。


产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌

1. DAPT检测MDR细菌的机理示意图。

本文重点:

1.本研究工作中,研究人员通过TEM、粒径分布、Zeta电位、XPSFT-IR证明了AptGNPs的成功合成,加入MRSA后,荧光强度的显著增加证明了荧光模式检测的可行性。


产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌

2. AptGNPs颗粒的基本性能分析。

通过TEM观察AptGNPs的颗粒大小和形貌。所制备的AptGNPs分散性好,平均粒径为135.3±5.8 nm,与GNPs相比,AptGNPs具有稍大的流体力学直径,这证实了GNPs表面适配子的成功修饰。Zeta电位的测量结果表明,AptGNPsZeta电位显著高于GNPs,证实负电荷的适配体已成功修饰在GNPs的表面。通过XPSFT-IR光谱对GNPsAptGNPs的表面化学成分和官能团进行了评估。此外,可以忽略的粒径和荧光变化,显示出AptGNPs良好的稳定性。BHQ2标记的适配体导致荧光处于“off”状态,然而,MRSA (104 CFU mL1替换 cy5 标记的探针时,荧光显示为“on”状态,即在加入MRSA后,观察到峰值荧光强度有明显的上升趋势,表明探针已成功释放。


2.研究人员首先对DAPT的实验条件进行优化,随后在DLS模式下对DAPT的运行性能进行研究,包括检测范围、检测限、特异性、重现性及真实样本的检测。


产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌

3. DLS模式下对DAPT性能研究。
研究人员对MB上修饰的适配体数量和捕获时间等实验参数进行优化。捕获效率随适配体用量的增加而逐渐增加,当浓度超过1.5 mM时,捕获效率趋于平稳,捕获的细菌随着培养时间的增加而增加,20 min后捕获的目标菌数达到90%以上。琼脂板照片表明磁捕获MRSA之前和之后的显著差异。TEM图像表明,AptGNPs可以选择性地与细菌结合形成“AptGNPs包被细菌”复合体,而AptGNPs的状态也随之从分散变为聚集。将AptGNP 与不同浓度的MRSA一起孵育,会导致AptGNP的平均DH出现明显的浓度依赖性增加。AptGNP 探针的平均DHMRSA 浓度(从~ 6×104 CFU mL1)具有良好的线性关系(R2 = 0.9943),线性回归方程为:y = 9.5154 ln(x) + 137.54,其中y表示AptGNPDHx表示MRSA的浓度,LOD 为 4.63 CFU mL1。在该模式下进行特异性和重现性验证,并在盐水和牛奶中进行加标回收实验,结果显示,盐水中的样品回收率为91.90% ~ 102.77%,牛奶中的样品回收率为95.00% ~ 99.40%
3.研究人员在荧光模式下对DAPT的运行性能进行研究,包括检测范围、检测限、特异性、重现性及真实样本的检测
产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌
4. 荧光模式下对DAPT运行性能研究。
由于DLS模式在高浓度细菌下易受到干扰,因此荧光模式可以作为DLS模式的有效补充。荧光图像显示,荧光强度随着MRSA的浓度(10 CFU mL1 ~ 106 CFU mL1)的增加而增加,荧光强度与MRSA的浓度具有较好的线性相关拟合Y = 139.5X + 253.7R2 = 0.9879),其中XY代表MRSA的浓度的对数和峰值荧光强度,LOD 为 13.42 CFU mL1DLS模式和荧光模式相互补充,弥补了单一模式检测性能的不足。在该模式下进行特异性和重现性验证,并在盐水和牛奶中进行加标回收实验,结果显示,盐水中的样品回收率为 97.41% ~ 101.10%,牛奶中的样品回收率为 96.30% ~ 99.43%
4.通过与传统培养方法进行比较,进一步证实了DAPT策略鉴定临床MRSA感染样本的能力。
产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌
5用临床样本比较传统培养方法DAPT策略鉴定临床MRSA感染样本的能力。
菌落图像表明,在阳性样本(样本1-7)中可以清楚地观察到细菌增殖,而阴性样本(样本8-10)在培养板上没有表现出增殖,此工作所阐述的DAPT 策略验证了临床阳性和阴性样本之间 DLS 信号和荧光强度的显著差异。计算阴性样本的平均值加上三个SD95%置信水平)以确定双模式的阈值,与培养方法相比,所提出的DAPT策略实现了菌落计数结果 100% 的准确性。此外,受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)为1.00,揭示了DAPT方法的高预测能力。
5.研究人员分别对MDR大肠杆菌、结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的相应序列(包括适配体和探针)进行了重新编程,以验证DAPT检测平台区分其他MDR细菌的通用性。
产品应用案例│一种简单且可编程的双模式适配体传感器用于超灵敏检测多重耐药细菌
6.发展通用的DAPT检测平台。
四种模式中,超过92%MDR细菌可以在25分钟内被捕获和分离,识别和检测过程可以在35分钟内完成,DAPT系统检测MDR细菌的通用工作流程可以在60分钟内完成。四种不同类型的 MDR 细菌交叉验证临床样本实验表明,只有相应的MDR细菌才能激活荧光强度并诱导粒径增加。DLS 信号和荧光强度都随着细菌浓度的增加而呈现出成比例的变化,表明该检测平台对其他MDR细菌的通用性
总结

通过以上实验,研究人员成功开发了一个通用的DAPT平台,用于超灵敏和准确地检测临床样本中的MDR细菌。所提出的DAPT策略的优越性主要取决于其两种模式的协同效应:(iDLS模式,它能够时实现超高灵敏度的精确检测,LOD4.63 CFU mL1,以及(ii)荧光模式,它是高浓度下可靠定量的有效补充。DAPT方法在概念验证实验和临床分析实践中都表现出出色的分析性能,包括准确性、选择性、重现性和可靠性。此外,DAPT平台显示出成为通过重新编程相应序列来区分各种MDR细菌的通用工具的巨大潜力。

参考文献:
[1] Zhao F, Zou M, Wu H, et al. A simple and programmable dual-mode aptasensor for the ultrasensitive detection of multidrug-resistant bacteria[J]. Biomaterials Science, 2023, 11(5): 1754-1764.

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