本月推荐│东纳生物MagBeads®外泌体提取磁珠
日期：
2025-04-23
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外泌体是一种具有磷脂双分子层的细胞外囊泡（EVs），直径在30-150纳米之间，由细胞响应各种环境刺激或自我激活而分泌。凭借其在细胞间通信中的关键作用，外泌体在药物递送、临床诊断和疾病治疗等领域展现出广阔的应用前景。然而，宿主细胞来源的外泌体原料中含有大量细胞碎片、脂蛋白及超聚体等杂质，为外泌体的高效分离带来了挑战。目前外泌体分离主要包括超速离心、沉淀法、过滤法以及基于磁珠的亲和捕获法。通常的磁珠亲和捕获法先在超速离心的基础上富集EVs，接着利用磁珠包被含有外泌体相关抗原的抗体（如CD9、CD63、CD81）与富集的EVs共同孵育，利用免疫的抗原与抗体特异性结合的方法富集外泌体（Exosome Isolation Kit Pan-human）。另一种商用的亲和捕获法是基于Tim4蛋白-磷脂酰丝氨酸（PS）亲和法（MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS，TransExo® PS Exosome Isolation Kit)。Tim-4蛋白是一种单链I型膜蛋白，能以钙离子依赖的方式与富含磷脂酰丝氨酸（PS）的外泌体结合，再经过含有EDTA的洗脱缓冲溶液进行分离，提取高纯度的完整外泌体。
南京东纳生物MagBeads® 1微米系列外泌体提取磁珠
南京东纳生物科技有限公司的MagBeads® 1微米系列外泌体提取磁珠，磁珠由优化结构的二氧化钛、聚苯乙烯和纳米氧化铁组成。磁珠分二氧化钛磁珠（薄壳层）和二氧化钛磁珠（厚壳层）两种。二氧化钛磁珠（薄壳层）为尺寸均一的单分散微米级磁珠，表面呈现纳米级粗糙度岛状结构，具较高的比表面积，较强的饱和磁化强度，快速的磁响应时间等优点。二氧化钛磁珠（厚壳层）表面包覆较厚二氧化钛壳层，这种结构更加稳定，能够用于更加剧烈的化学环境。二氧化钛磁珠集合了磁性材料快速外磁场响应和金属氧化物稳定性的优点，具有很高的比表面积，可以通过和EVs双层磷脂的磷酸基形成双齿结构捕获EVs，并通过磁分离将磁珠-EVs复合物进行分离。磁珠和EVs的结合是可逆的，通过碱性溶液清洗，便能洗脱和收集所捕获的EVs。
图：二氧化钛磁珠SEM图及富集外泌体的原理图
1. 血液样本收集要求
具体操作步骤:
（1）空腹静脉采血，不要收集前2-3 mL血液，静脉采血后收集至EDTA抗凝管（含有K2EDTA抗凝剂）中。收集完毕后，将抗凝管轻轻倒转8-10次。
（2）采集后半小时内，将样品离心10 min，离心条件:室温，1000 g。
（3） 离心完毕后，轻轻吸取分界面0.5 cm以上的浅黄色血浆至新无酶离心管中，留下约0.5 cm的血浆在分界面缓冲层之上，不要扰动分界面避免污染。
（4）将新无酶离心管中的样品离心10 min，离心条件:室温，2500g。
（5）第二次离心后，弃掉底部20 μL的血浆，将血浆上方部分重新转移至新的离心管中。
（6） 将新离心管移入-80℃冰箱内保存。
具体步骤如下：
将收集的细胞上清液在4℃下依次进行以下离心操作，以去除细胞及细胞碎片：
（1）300 × g 离心10 min；
（2）2000 × g 离心10 min；
（3）10000 × g 离心30 min;
随后，将上清液在4℃下以100000 × g离心70 min，所得沉淀用PBS洗涤后，再次在4℃下以100000 × g离心70 min。最后，将得到的沉淀（外泌体）分散于500 μL PBS（pH 7.4）中，于-80℃保存，作为外泌体标准品，用于后续实验。
实验方法：
参照Zhang1描述的方法，制备两份浓度相同的标准外泌体平行样品，利用PKH26染色法评估TiO₂磁珠捕获外泌体的效率。具体操作如下：
• 样品I：用PKH26染料染色外泌体，测定荧光信号强度，记为 F0；
• 样品II：将外泌体与TiO₂磁珠孵育后进行磁分离，测定上清液的荧光信号强度，记为 F1。捕获效率计算公式：
捕获效率与样品I和样品II荧光信号强度的差值成正比。
关于PKH26：
PKH26是一种专用膜标记探针，其结构含有一条长脂肪族尾巴，可稳定插入细胞膜的脂质区域。（注：也可选用其他膜标记探针，如Dil等。）
PKH26染色具体步骤：
（1）取4 μL PKH26溶于1 mL稀释液C中，配制成A液；
（2）取10 μL浓度为1010个/mL的外泌体，加入1 mL稀释液C中，配制成B液；
（3）将A液与B液混合，孵育1-5 min；
（4）加入2 mL 1% BSA溶液，孵育1 min以终止反应；
（5）用离心机富集外泌体，随后用HEPES缓冲液（10 mM, pH 7.0）在4℃、12000 rpm条件下洗涤3次，每次10 min。（注：条件允许时，建议提高转速，PKH26染色具体步骤可参考PKH26说明书。）
优化实验：
通过控制变量法分别优化TiO₂磁珠的用量和孵育时间，以提高外泌体捕获效率。
实验步骤：通过控制TiO₂磁珠用量和孵育时间，优化TiO₂磁珠捕获外泌体的条件。实验在37℃下振荡进行，使用HEPES缓冲液（10 mM , pH 7.0）作为结合液。结合完成后，用HEPES缓冲液洗涤两次，以去除未结合的外泌体。
实验结果表明，当TiO₂磁珠用量为1.4 mg/mL，孵育时间为7 min时，捕获效率达到最高。
参照Zhang1描述的方法，首先通过低速离心去除血浆样本中的细胞及细胞碎片，然后使用0.22 μm滤膜过滤以去除大的细胞外囊泡。取20 μL过滤后的血浆样本与TiO2磁珠在HEPES缓冲液（10 mM, pH 7.0）中孵育，以捕获血浆样本中的外泌体。结合条件是：磁珠用量1.4 mg/mL, 孵育时间7 min，温度37℃，期间需振荡以确保充分结合。随后加入相应信号标签以检测外泌体。临床样本的检测步骤与纯外泌体样本一致。对照组使用20 μL不含血浆的HEPES缓冲液作为空白。
洗脱液配方：10% NH3･H2O溶液（pH 11.1）
洗脱过程：参照Pan2描述的方法，将TiO₂磁珠与外泌体复合物置于37℃振荡器中，加入到10% NH3･H2O溶液中孵育10分钟，以确保外泌体从磁珠上充分释放。随后，快速进行磁分离，通过超滤系统（30 kDa）将上清液中的NH3･H2O溶液替换为PBS缓冲溶液（pH 7.4），并用PBS缓冲液洗涤3次。通过纳米颗粒跟踪分析技术，来验证洗脱效率。经验证，TiO₂磁珠捕获外泌体的效率为90%以上。
参考文献
(1) Pang, Y.; Shi, J.; Yang, X.; Wang, C.; Sun, Z.; Xiao, R. Personalized detection of circling exosomal PD-L1 based on Fe3O4@TiO2 isolation and SERS immunoassay. Biosensors and Bioelectronics 2020, 148, 111800. DOI: 10.1016/j.bios.2019.111800.
(2) Pan, Y.; Chen, T.; Zhang, Q.; Cao, L.; Wang, S.; Cai, J.; Xu, J.; Shi, M.; Ruan, L.; Zhu, Q.; et al. Highly Selective Purification of Plasma Extracellular Vesicles Using Titanium Dioxide Microparticles for Depicting the Metabolic Signatures of Diabetic Retinopathy. Analytical Chemistry 2022, 94 (41), 14099-14108. DOI: 10.1021/acs.analchem.1c05378.
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