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产学研合作: 氟化PEG-PEI磁转染载体递送siRNA敲低CXCR4表达

日期: 2022-09-15
浏览次数: 10

好磁珠 东纳造

产学研合作:
氟化PEG-PEI磁转染载体递送siRNA敲低CXCR4表达


   简  介  
      目前,阳离子聚合物修饰的磁性纳米颗粒被广泛用于核酸递送,且利用外部磁场可以进一步提高转染效率。此外,聚乙二醇(PEG)修饰可以提高纳米颗粒的生物相容性,但PEG亦可能降低纳米颗粒被细胞摄取的效率。

      现有研究表明,氟化修饰是提高纳米颗粒的细胞摄取率的有效方法。有鉴于此,东南大学研究者联合南京东纳生物科技有限公司共同开发了氟化PEG-PEI修饰的磁转染载体,可以显著提高PEG化纳米颗粒被细胞摄取和转染的效率。该研究首先制备了七氟丁酰-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F7-PEG-PEI, FPP),然后将其用于包覆磁性纳米颗粒(MNPs)以获得磁性纳米载体FPP@MNPs。并在4T1乳腺癌细胞系上验证了向肿瘤细胞转染siRNA以敲低CXC 趋化因子受体4(CXCR4)的表达。
产学研合作: 氟化PEG-PEI磁转染载体递送siRNA敲低CXCR4表达

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  结果与分析 

01

MNPs经过FPP修饰后,尺寸从17.27±0.32 nm增加到93.29±7.31 nm, zeta电位从-45.57 mV 增加到56.77 mV,表明 FPP 吸附在 MNP 的表面。
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图1.(a) FPP的19F-NMR谱; (b) OA@MNP的TEM图;(c) DMSA@MNP的TEM图; (d) FPP@MNPs的TEM图; (e) FPP@MNPs 的HAADF图像; (f) FPP@MNPs的F元素分布;(g) FPP@MNPs的Fe元素分布; (h) MNP的磁化曲线; (i) DMSA@MNP 和 FPP @MNP 的水动力尺寸; (j) DMSA@MNP 和 FPP @MNP的Zeta电位; (k) OA@MNP的 HRTEM 图像;(l) OA@MNP的 SAED 图像




02


以表面修饰mPEG-PEI的MNPs (mPP@MNPs) 为对照,FPP@MNPs的细胞摄取效率明显提高(颗粒均含有FITC标记)。
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图2. 共聚焦显微镜拍摄HeLa细胞摄取 (a) FPP@MNPs;(b) mPEG-PEI@MNPs。蓝色荧光为细胞核,红色荧光为溶酶体,绿色荧光为FITC标记的纳米颗粒。(标尺= 20μm)



03


随后作者采用绿色荧光标记的siRNA阴性对照(FAM-siRNA NC),通过流式细胞术检测Lipo3000转染HeLa细胞作为对照,分别采用0.25 μg、0.5μg、0.75μg、1.0μg的FPP@MNPs在有外部磁场增强(mag+)或无磁场(mag-)的条件下转染HeLa细胞,并检测转染效率。结果表明外部磁场可以有效提高转染效率,采用0.5μg、0.75μg、1.0μg的FPP@MNPs用于转染,效率均高于90%。转染后细胞的平均荧光强度(MFI)同样有显著提高,表明外部磁场的作用不仅可以提高转染效率,而且可以增加转染入细胞的siRNA含量。
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图3.流式细胞术检测转染效率。(A)对照 (B) Lipo 3000 转染 (a-d) 40 pmol FAM-siRNA 与 0.25μg、0.5μg、0.75μg 或 1.0μg FPP@MNPs,磁场增强转染 (mag +)。(e-h) 40 pmol FAM-siRNA 与FPP@MNPs (mag-)。(i) Lipo3000、mag + 和 mag- 的转染效率。(ii)转染后的平均荧光强度




04


采用FPP@MNPs,分别转染三条可敲低CXCR4的siRNA(序列R1~R3),并转染4T1细胞,通过流式细胞仪检测转染24 h或48 h后CXCR4的表达。

结果表明,转染24 h后,与阴性对照组相比,R2、R3组CXCR4表达下降,而R1组CXCR4表达升高。48 h后,与转染24 h的细胞相比,R1、R2和R3组CXCR4的表达降低。但R1的敲低效率仍低于R2或R3。CXCR4敲低率随着转染细胞的培养时间从24 h增加到 48 h而增加。三个siRNA序列(R1、R2、R3)的效率相比,R1的效果较差,R2与R3的差异不显著。
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图4. 流式细胞术检测4T1细胞CXCR4表达(以阴性对照为基准归一化处理相对表达量)(a-c)转染后 24 小时的荧光强度;(d-f)转染后 48 小时的荧光强度; CXCR4由Cy5标记的抗体检测,黑线峰为阴性对照; (i) RT-PCR 检测CXCR4 mRNA;(ii) 流式细胞术检测CXCR4 表达的相对量





总结
这项研究中,作者开发了一种磁性氟化siRNA载体FPP@MNPs,该载体在常规剂量下对细胞的毒性较小,结果表明氟化是克服“PEG困境”并提高细胞摄取效率的有效策略,FPP@MNPs可以达到90%以上的转染效率。尤其是少量的FPP@MNPs,也可以通过外部磁场进一步提高转染效率。体外实验证实,该载体在不同细胞上具有通用性,并在4T1乳腺癌细胞系上验证了CXCR4表达的敲低。


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参考文献:
[1] Cao, Y.; Zhang, S.; Ma, M.; Zhang, Y. Fluorinated PEG-PEI Coated Magnetic Nanoparticles for siRNA Delivery and CXCR4 Knockdown. Nanomaterials 2022, 12, 1692. 


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始 于 微 纳     止 于 至 善


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