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浅谈化学发光免疫分析技术与磁性微球

日期: 2020-12-25
浏览次数: 572
化学发光免疫分析技术(Chemiluminescent immunoassay)


化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时,吸收了反应过程中所产生的化学能,使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态,当电子从激发态回复到基态时,以发射光子的形式释放出能量,这一现象称为化学发光。
将待测物从复杂的样本环境中检测出来是极具挑战性的,针对不同的样本和检测项目,其检测方式具有极高的浓度依赖性。当检测浓度大于1ng/mL时,可以采用胶乳增强免疫比浊方法;当检测浓度低于1ng时,可以采用ELISA、免疫荧光等;当检测浓度低于500pg/mL时,需要采用具有信号放大功能的化学发光和放射免疫测定法。又因为放射免疫测定的废弃物具有放射性,还需要特殊处理。因此,化学发光免疫分析成为了时下热门的免疫检测方式。不仅如此,化学发光还具有自动化、高通量(多个样本测试,多项检测项目测定)等优点

磁珠法化学发光检测原理
磁珠法化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者相结合的一种分析方法,充分利用了磁性分离技术的快速易自动化优势,化学发光技术的高灵敏度及免疫分析的特异性。
磁珠法化学发光通过一定的方法将抗体/抗原等活性物质和磁珠表面的活性基团结合而包被在磁珠上,检测时,将待检物和包被有抗体/抗原的磁珠,化学发光分子标记的抗体/抗原在一定条件下孵育,通过抗原抗体反应而结合,通过增加外部磁场,磁珠产生磁性而聚集在一起,便可进行洗涤,实现结合部分和未结合部分的分离,最后对化学发光分子进行激发,用光电倍增管检测信号。
抗体/抗原在磁珠上的包被有直接标记法链霉亲和素法两种方式,通常来说抗体/抗原的直接包被受到所包被抗体/抗原的等电点、分子大小的影响,需要优化包被方案,链霉亲和素包被法则可通过生物素化抗体/抗原直接与链霉亲和素包被的磁珠相结合,更具有普适性。磁珠法化学发光的一次检测需要消耗磁珠25 μg左右,而抗体的消耗量是0.025-0.05 μg,因此磁珠是法化学发光试剂消耗量最大的原料。

浅谈化学发光免疫分析技术与磁性微球

图1 免疫夹心法检测原理

磁性微球的选择
化学发光已经离不开磁性微球了,因此选择合适的磁性微球显得十分重要。通常从以下5个方向进行考量。

1、磁性微球的尺寸
磁性微球具有不同的尺寸,100nm到3μm不等。一般来说,小尺寸的磁性微球具有更多的优势,大的比表面积,极高的稳定性等。但是小尺寸的磁性微球磁分离速度较慢,因此,常常需要尝试不同尺寸的磁性微球,以寻求最佳的检测效果。这里需要提出的是,化学发光用磁珠的经典尺寸是1μm,大多数体系应用的都是这个尺寸。

2、磁性微球材料
制备磁性微球的材料多种多样,常见的有聚苯乙烯、聚苯乙烯 - 二乙烯基苯等。

3、磁性微球的密度
磁性微球的密度是很难估算出来的,一般都是用磁性微球的磁性物质(无机金属氧化物,如氧化铁等)含量来表示的。磁性物质含量越高,磁性越好,磁分离效率越高。值得注意的是,磁性物质含量高的磁性微球容易在溶液中沉降,聚集,也不利于检测。

4、磁性微球表面特点
由于需要保存抗体在磁性微球表面附着的效率和活性,因此,磁性微球表面性能显得尤为重要。不同的磁性微球表面具有不同的特点。一般来说,磁性微球表面可以分为:
平板表面:不具备功能基团,通常采用被动方式锚定抗体,比如静电作用;
带有功能基团的表面:通常是羧基、氨基、羟基、巯基等,这些功能基团能够与抗体形成共价结合,稳定的锚定在磁性微球表面;
生物活性表面:带有链霉亲和素、抗IgG蛋白,或者蛋白A等。这种表面通常可以直接和抗体结合,不需要过多的步骤,最大程度地保留抗体的活性。但是这种磁性微球价格通常比较贵。

浅谈化学发光免疫分析技术与磁性微球

 
图2 功能基团和生物活性表面磁性微球

5、批量大小
选择100g还是10kg是个问题,而且是一个重要的问题,特别是当需要将产品大规模推向市场的时候。小批量的磁性微球需要做详细的批间测试,而大批量的磁性微球则避免了这种麻烦。
磁性微球的选择可以多种多样,据了解,市面上80-90%的公司,其选择都是表面羧基、氨基等生物活性,磁性物质含量在30-60%,粒径在0.7-1.4微米的磁性微球,能够更好程度地达到化学发光的效果。







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