图 3. CuCo-ZIF/Pt类氧化酶活性的表征。(A) OPD、CuCo-ZIF+OPD和CuCo-ZIF/Pt+OPD体系的紫外-可见吸收光谱。插图：不同反应体系的颜色变化照片。(B) OPD、CuCo-ZIF + OPD 和CuCo-ZIF/Pt + OPD的时间-吸光度曲线。(C) 不同纳米酶的a_nano比较。(D) CuCo-ZIF/Pt 对OPD的酶促反应动力学和 (E)相应的双倒数图。(F) 不同气体饱和条件OPD/CuCo-ZIF/Pt溶液的吸光度变化。(G) 不同自由基清除剂对CuCo-ZIF/Pt类氧化酶活性的影响。(H) DMPO捕获的•OH和O_₂^•–以及TEMP捕获的^¹O_₂的ESR谱图。(I) CuCo-ZIF/Pt纳米酶的重复使用性能。

电化学测试结果表明，Pt NPs的引入显著增强了CuCo-ZIF电荷传递能力并提高了活性位点密度。DFT计算揭示Co和Pt为主要的O_₂吸附活性中心，其中CuCo-ZIF/Pt对O_₂结合能力更强，有效促进了OOH^*→OH^*→H_₂O的反应路径。XPS分析证实，催化反应后Cu^²⁺和Co^³⁺被还原为Cu^⁺和Co^²⁺，同时Pt^²⁺的相对含量增加。这些结果共同表明，高价态金属直接参与了OPD的氧化过程，并与反应过程中产生的活性氧物种（ROS）协同完成催化循环。

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图4. CuCo-ZIF/Pt类氧化酶催化机理研究。(A) EIS奈奎斯特图。(B) 5 mV/s下的LSV曲线。(C) 腐蚀电位极化曲线。(D) CuCo-ZIF/Pt优化吸附构型的O₂还原反应路径。(E) CuCo-ZIF和CuCo-ZIF/Pt类氧化酶反应对应的自由能图。反应前后(F) Cu、(G) Co和(H) Pt的XPS图谱。

该多模态生物传感器在优化条件下表现出卓越的分析性能。在比色模式下，其线性检测范围为4.7×10^⁴-9.4×10^⁶ 个/μL，检测限为3.2×10^⁴ 个/μL；荧光检测模式同样呈现良好线性，检测范围为9.4×10^²-9.4×10^⁶ 个/μL，检测限为8.05×10² 个/μL。实验结果表明，该传感器具有优异的选择性、重复性和稳定性。通过结合ResNet18-DA人工智能平台，基于8000张训练图像构建的智能识别系统可实现1秒内的快速检测，准确率超过99.5%。该集成系统突破了传统检测方法的局限性，为sEVs的即时检测提供了新的解决方案。

图5. CuCo-ZIF/Pt纳米酶对sEVs的多模态传感性能分析。(A) 生物传感器对不同浓度sEVs 的比色响应。(B) 吸光度值与sEVs浓度之间的关系。(C) 在 4.7×10⁴-9.4×10⁶个/μL的范围内，吸光度值与sEVs浓度之间的线性关系。(D) 生物传感器对不同浓度sEVs的荧光响应。(E) 荧光强度与sEVs浓度之间的关系。(F) 在 9.4×10²-9.4×10⁶个/μL 的范围内，荧光强度与 sEVs浓度之间的线性关系。(G) ResNet18-DA 模型训练过程示意图，包括一个输入层、一组隐藏层和一个输出层。(H) 使用 ResNet18-DA 模型预测sEVs浓度的混淆矩阵。(D) 基于比色图像的机器学习辅助sEVs检测示意图。

该生物传感器在24例临床样本验证中展现出优异的诊断性能。采用梯度离心结合0.22 μm滤膜预处理的血浆样本检测表明，淋巴瘤患者组sEVs的CD20标志物信号强度显著高于健康对照组（P<0.001，t检验）。与ELISA金标准方法相比，该传感器在诊断效能上具有明显优势，比色检测模式的受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到0.948，荧光检测模式AUC为0.963（ELISA方法AUC=0.933），且具有更高的灵敏度和更短的检测时间。基于ResNet18-DA模型对临床样本的预测准确率良好。这些结果表明，该传感器在淋巴瘤临床诊断中具有显著优势，其高灵敏度和特异性为肿瘤生物标志物的检测提供了新工具。

图 6. 健康受试者和淋巴瘤患者的血浆sEVs分析。(A) 血浆 sEVs 的分析过程。(B) 比色法和荧光法检测不同人群中的sEVs浓度。(C) 临床血浆样本中sEVs上CD20检测的ROC曲线。

综述所述，本研究成功构建了一种基于纳米酶的多模态传感平台，实现了淋巴瘤EVs上 CD20的检测。该平台具有三大优势：(1) 采用Fe_₃O_₄@TiO_₂亲和磁珠实现sEVs快速富集；(2) 基于CuCo-ZIF/Pt纳米酶催化系统无需H_₂O_₂即可产生比色和荧光双响应信号；(3) 集成ResNet18-DA深度学习模型，实现1秒内智能分析，准确率接近100%。该技术为淋巴瘤诊断和疗效评估提供了高效、精准的新方法。

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