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产品应用案例|等温扩增联合荧光免疫层析实现沙门氏菌的快速定量检测

日期: 2022-10-19
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产品应用案例|等温扩增联合荧光免疫层析实现沙门氏菌的快速定量检测
产品应用案例|等温扩增联合荧光免疫层析实现沙门氏菌的快速定量检测


沙门氏菌是引起重大公共卫生关注的人畜共患病病原体,据不完全统计,沙门氏菌每年在全球造成估计高达13亿人的胃肠道感染。通常情况下,沙门氏菌的感染源是受污染的食物或水。
传统的沙门氏菌检测方法主要为细菌分离鉴定,结合血清学分析。基于培养方法,可区分2600多个血清型,并可提供分离株进行药敏试验,然而通常需要耗费5-7天,繁琐且耗时,而且不同种类的肠杆菌科之间可能会发生交叉生化反应。横向流动免疫分析(lateral flow immunoassaysLFIAs)比色法方便简单,可以根据色差读出定性结果,但定量评估往往不准确,无法对测试结果进行可靠的量化表示。此外,基于琼脂糖凝胶电泳法的常规分子检测方法,如PCR和等温扩增分析,检测时为了显示凝胶上的扩增产物,使用溴化乙锭等荧光染料,会对实验者的健康构成潜在的威胁。实时定量PCRqPCR)不需要使用凝胶电泳法,但由于其设备和试剂的昂贵而没有得到广泛应用。
为了能够在现场或无仪器条件下进行检测,Linlin Zhuang等开发了一种基于链交换扩增(strand exchange amplificationSEA)和LFIAs的快速、稳定的分析方法SEA-LFIAlateral flow fluorescent immunoassay combined with strand exchange amplification),用于沙门氏菌的定量检测(图1)。该方法应用磁珠(购自东纳生物)对基因组DNA进行快速、高效地提取,提取过程可以在30分钟内完成;使用功能化纳米颗粒作为信号放大器,大大提高LFIA荧光传感的灵敏度;使用LFIA传感器Nanoeasy 1700(购自东纳生物)和荧光成像仪(购自东纳生物)量化结果,没有假阳性或阴性,能够快速、特异地检测沙门氏菌,有望成为现场检测食源性病原菌的有效方法。

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1SEA-LFIA法检测沙门氏菌的图示。

 本文重点 


1. SEA-LFIA方法的建立和优化

Linlin Zhuang等针对目前为止沙门氏菌中发现的最保守的菌毛操纵子之一的bcfc基因保守区设计了一对特异性引物(P1GTATTGCATGGAGCGTTTCTTP2GCCTGCGGATTTGTTATTGT),扩增片段为44 bpPrimerBLAST程序分析表明,所设计的引物与沙门氏菌的同源性为100%,与非沙门氏菌的相似性较低。根据引物的Tm值和BST DNA聚合酶的最适温度,以肠炎链球菌ATCC13076的基因组DNA为目标,确定61℃反应25 minSEA的最佳反应条件。
在优化SEA反应条件的基础上,Linlin Zhuang等建立了肠炎链霉菌(S.enteritidisATCC13076阳性样品和阴性样品(E.coliATCC25922)基因组DNASEA-LFIA检测方法,并对其稳定性进行了检验。LFIA传感器Nanoasy 1700显示,只有阳性样品在T线上显示出特征扩增峰,而阴性样品没有。定量结果显示,阳性样品的荧光值在34718~40539之间,变异系数为0.06。阴性样品的荧光值在4~12之间,变异系数为0.28。相应地,阳性样品在T线和C线上都显示出亮带,而阴性样品只在C线上显示出亮带。(图2

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2:沙门氏菌SEA-LFIA检测方法的建立。(A)使用Nanoasy 1700读取以阳性样品为模板的SEA荧光值。(B)(A)相同的样品所对应的T线和C线的荧光图像。(C)使用Nanoasy 1700读取以阴性样品为模板的SEA荧光值。(D)(C)相同的样品所对应的T线和C线的荧光图像。

2. SEA-LFIA方法检测沙门氏菌的特异性

为了验证SEA-LFIA方法的特异性,该研究选用了18株沙门氏菌参考菌株和15株非沙门氏菌参考菌株(不同属)进行检测。结果表明,只有沙门氏菌菌株在测试线上显示出特征扩增峰,而非沙门氏菌菌株和阴性对照没有显示出扩增峰。(图3

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3SEA-LFIA法检测沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株的特异性验证。所检测的18个沙门氏菌参考菌株均出现了特征扩增峰,而15个非沙门氏菌参考菌株和阴性对照均未出现特征扩增峰,可知SEA-LFIA法具有良好的特异性。

3. SEA-LFIA法检测沙门氏菌的灵敏度

为评价SEA-LFIA检测沙门氏菌的灵敏度,Linlin Zhuang等以人工添加沙门氏菌的生鸡样品中提取的细菌基因组DNA为模板进行检测,浓度范围为3×107CFU/25g~3×100CFU/25g。结果表明,在3×104CFU/25g浓度下,特征扩增峰清晰可见,但在浓度降至3×103CFU/5g时,特征扩增峰消失。作为LFIA的质控,C线上有明显的荧光信号,说明定量结果是有效的。SEA-LFIA方法在未浓缩样品中的灵敏度与基于LAMP的生物发光方法相似,在已报道的基于核酸扩增检测沙门氏菌的研究中,加标实验的检测范围为104CFU/25g~108CFU/25g。本研究中,SEA-LFIA方法对人工添加的生鸡肉的检测限为3×104CFU /25g,与以往的研究相当。

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4SEA-LFIA法检测沙门氏菌的灵敏度验证。检测对象为人工接种沙门氏菌的生鸡肉,模板浓度为3×107CFU/25g3×100CFU/25g。由图像可知,SEA-LFIA法对人工生鸡肉的检测限为3×104CFU/25g

4. SEA-LFIA法检测沙门氏菌的准确性

SEA-LFIA检测沙门氏菌的方法,与传统的培养方法和凝胶聚合酶链式反应(Gel-Based PCR)进行比较。在采集的236份样本中,37份(16%)经SEA-LFIA检测呈阳性,分别从生肉(19%23/118)、生奶(15%5/33)、水产品(10%4/39)和腐肉制品(11%5/46)中检出。SEA-LFIA的临界值(阴性样品的平均值加上3倍标准差)为15Gel-Based PCR法检测结果与SEA-LFIA法一致。传统培养方法检出沙门氏菌32份,SEA-LFIA检测结果为阳性。另外5份可疑样本(3份来自生肉,1份来自生奶,1份来自焦炭制品)经PCR扩增后DNA测序呈阳性。在多个样本中的检测结果与以往的报道一致,也证明了基于核酸的检测方法的准确性优于传统的培养方法。

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5:对236份样本进行SEA-LFIA法沙门氏菌检测,“◆”“◇”分别表示阳性和阴性结果,37份样本(16%)经SEA-LFIA检测呈阳性,荧光值远高于阴性样本。

表1:对236份样本进行SEA-LFIA、传统培养方法和PCR-凝胶电泳法沙门氏菌检测的检测结果。

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 总结与展望 


综上所述,本工作开发的SEA-LFIA方法对沙门氏菌的检测具有优良的特异性和灵敏度,从经济角度来看,该研究中的SEA-LFIA方法在试剂和耗材成本上与基于凝胶的PCR相似,但它消除了对安全性较低的电泳实验和昂贵设备的需要,并且SEA-LFIA法只需28分钟即可完成检测,远远少于基于凝胶的PCR所需的时间(2-3小时),而且SEA-LFIA每次检测的样本数量不受限制。因此,考虑到经济、时间和人力成本,SEA-LFIA法在批量检测、现场检测和无仪器条件下具有明显的优势,有望成为现场检测食源性致病菌的有效方法。
参考文献:
Zhuang L, Gong J, Ji Y, et al., Lateral flow fluorescent immunoassay based on isothermal amplification for rapid quantitative detection of Salmonella spp. Analyst. 2020, 145(6): 2367-2377.
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